智能液晶操作 集菌仪 ZW-808A 踏板控制开关 无菌培养器 

基于滤膜上细菌直接计数法的细菌总数检测
【摘要】 细菌总数检测在质量监测中具有重要的意义，目前除了经典的平板培养法以外，还有微菌落法、阻抗法等检测方法，这些方法或者需要较长的检测时间，或者需要较高的检测成本。本研究提出一种不需要培养而在滤膜上直接计数的细菌总数的检测方法，它主要分为过滤、染色、显微镜计数和计算四个步骤。计算细菌总数时，根据细菌在滤膜上的分布特点，对传统公式进行改进，提出按区域计算细菌总数的计算方法，提高了检测精度。研究结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性差异（t=0.847，P=0.436＞0.05），是一种、快速的细菌总数方法。
1 引 言
细菌总数计数的研究已有很多，目前国标规定的方法为平板计数法，该方法是将样品加入琼脂营养基，在37 ℃下培养24～48 h后计数。这种方法精度高，但耗时长，难以满足实际工作需要。为了简化检测程序、缩短检测时间，国内外学者进行了大量的检测方法的研究，提出了阻法〔1〕、Simplate TM全平器计数法〔2〕、微菌落技术〔3-5〕、纸片法〔6-7〕等检测方法，取得了的成果，但检测时间仍在4 h以上。
本研究在分析了已有研究成果的基础上，提出了在滤膜上染色后，直接计数的细菌总数检测方法，具体步骤为：用集菌仪进行细菌收集→在膜上进行染色→在油镜下计数→按公式计算出菌液浓度。实验结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性差异，检测时间约1 h，是一种快速的细菌总数方法。
2 材料与方法
2.1 材料
本研究中用的试验材料有集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），染色剂，生物显微镜（宁波永新光学股份有限公司），聚碳酸脂膜（直径47 mm）。
2.2 实验方法
2.2.1 准备工作 卸下集菌仪的滤网（见图1），统计滤网上小孔总数，为计算菌液浓度做准备。另外，还需对集菌仪中的集菌器进行高压灭菌，以防止过滤过程中引入外源细菌。
2.2.2 细菌收集 取浓度的霉菌菌液300～500 ml，装在集菌仪上，集菌仪采用蠕动加压方式对菌液施加的压力，使菌液流过孔径为0.45 um的聚碳酸脂膜。采用过滤方法是因为它可以使细菌相对均匀地分布在滤膜上，而选用聚碳酸脂膜是因为这种膜具有良好的透光性，便于用显微镜观察。
2.2.3 染色 集菌后取下滤膜，切下一部分放在载玻片上，进行染色、固定。染色的目的是增大细菌与背景的对比度，便于观察。
2.2.4 显微镜计数与计算 菌液经集菌仪过滤后，细菌在滤膜上的分布见图2、图3，由图可以看出细菌分布具有以下两个特点：一是细菌集中在一个个的圆形区域内，这些圆形区域和挡板的小孔相对应；二是各个圆形区域之间细菌很少。根据膜上细菌分布的这种特点，提出以圆形区域为单位进行计数，统计出圆形区域内细菌的平均个数，从而计算出菌液中细菌总数。具体步骤如下：随机选择10个圆形区域，在油镜下，调节焦距以获得较清晰的图像（见图4），统计每个圆形区域内的细菌个数，然后按公式(1)计算出菌液的浓度。

微生物实验室要不同于一般的实验室工程或净程。集菌仪主要应用于微生物学、生物医学、生物化学、动物实验、基因工程以及生物制品等研究使用的实验室统称为生物安全实验室，一般由主体实验室和辅助功能实验室组成。生物安全实验室保证人身安全、环境安全、废弃物安全和样本安全，能长期而安全的运行，同时还为需要实验室工作提供一个舒适，而良好的工作环境。微生物实验室设计
 
微生物实验室由准备室、灭菌室、无菌室、限度室、阳性对照室、恒温培养室和观察室组成。也根据具体实验需求配有样品室、洗涤室、学室、鉴定分析室及废物处理室等。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。微生物实验室基本构架
 
1、 准备室(前处理室)
 
主要用于配制培养基和样品处理等。
 
配套设施：冰箱、电炉、柜/试剂柜、存放器具或材料的专柜、加热搅拌器、离心机等。
 
2、 洗涤室
 
准备室主要用于洗刷器皿等。集菌仪
 
配套设施：加热器、蒸锅、洗刷器皿的器具、器具柜等。
 
3、灭菌室
 
主要用于培养基的灭菌和各种器具器材的灭菌。
 
配套设施：高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设施。4、无菌室(接种室)
 
主要用于系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。
 
基本建设：无菌室应设有内外两间，内间是无菌室外间室缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。小内间面积2*2.5，外间面积1*2，高以2.5m2以下为宜。
 
配套设施：高温灭菌炉、超声波清洗器、高压水、快速灭菌炉、生物安全柜
 
5、阳性对照室
 
主要用于做阳性对照实验的接种、检测方法及培养基或其他试剂的适用性验证。
 
配套设施：生物安全柜、集菌仪/限度仪、过滤器、混合器
 
6、培养室
 
应设有内外两间，内间为培养室、外室为缓冲室。房间容积不宜过大，以利于空气灭菌，内室面积在3.2*4.4左右，外室在3.2*1.8左右，为满足微生物对温度的需求，需安装恒温恒湿机，内外室均应在中央安装紫外线灯。
 
配套设施：培养架、摇床、各类培养箱
 
7、观察室
 
主要用于对微生物的观察、计数和生理生化的测定。
 
根据实验需求普通实验室配制不同，一般均配备实验台、显微镜、试剂柜